Moderne Methoden machen den Nachweis sicherer
Schaderregernachweis mittels Real-time PCR

Freisetzung von Fluoreszenzstrahlung während der Realtime PCR

Die Real-Time PCR wird in vielen Bereichen der Diagnose eingesetzt. Sie findet als molekulargenetische Methode nicht nur in der "roten" Medizin, Forensik, Umweltanalytik und in der Forschung immer mehr Anwendung, sondern wird verstärkt auch in der "grünen" Medizin, der Phytomedizin, bei der Diagnose von Pflanzenkrankheiten eingesetzt. Sie ist an der Bayerischen Landesanstalt für Landwirtschaft (LfL) zu einer Routinemethode beim Nachweis von Pflanzenkrankheiten geworden und eine wichtige Säule in der Diagnostik zur Ergänzung anderer molekularbiologischer, serologischer und konventioneller Diagnoseverfahren.

Zoombild vorhanden

Thermocycler

Die PCR, d. h. die Vervielfältigung der DNS, wird in einem Thermocycler durchgeführt. Der Thermocycler ist ein Mikroprozessor-gesteuertes Gerät: Es werden erregerspezifisch Programme mit bestimmten Temperaturschritten eingespeichert, in denen bestimmte Temperaturen ganz exakt über eine jeweils bestimmte Zeitdauer eingehalten werden. Im Programm ist auch die Anzahl der Wiederholungen der Reaktionsschritte gespeichert als Voraussetzung dafür, dass eine Kettenreaktion überhaupt abläuft. Während der Real-PCR misst der Thermocycler außerdem die in Anwesenheit des Erregers freigesetzte Fluoreszenzstrahlung. Über die Gerätesoftware werden die Daten aufgezeichnet und können am Ende analysiert werden.

Real-time PCR, eine Methode zum Nachweis von Schaderregern

Wie die Real-time PCR funktioniert und wie sie abläuft sehen Sie auf 36 Bildern

Real-time PCR - einfach erklärt 1,1 MB

1. Zuerst wird die Pflanzenprobe homogenisiert und die Erbsubstanz des Erregers aus der Pflanzenprobe isoliert.
2. Die aufgereinigte Erbsubstanz des Erregers (in der Regel DNS), die dann zusammen mit der Erbsubstanz der Pflanze vorliegt, wird mit einer Reihe von Reagenzien versetzt: Unter anderem werden sogenannte Primer, die einen bestimmten Bereich der DNS des Erregers umspannen, und eine Gensonde eingesetzt, die innerhalb dieses Bereichs an die DNS anbindet. Primer und Gensonden erkennen ganz spezifisch einen bestimmten Erreger. Außerdem enthält dieser Cocktail aus Proben-DNS und Reagenzien ein bestimmtes Enzym, die Polymerase, das dann später während der PCR die Erreger-DNS vervielfältigt.
3. Alle Reaktionskomponenten befinden sich in einem kleinen Reagenziengefäß, welches zusammen mit anderen Proben in den Thermocycler gestellt wird. Die speziell für den Nachweis eines bestimmten Erregers im Thermocycler eingespeicherten Temperaturschritte werden während der PCR in der Regel 35-40 Mal wiederholt. Dabei vervielfältigt die Polymerase ausschließlich den ausgewählten, von der Primern umspannten Bereich der Erreger-DNS.
4. Parallel zu den Primern bindet auch die Gensonde an diesen DNS-Bereich. Die Gensonde ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff, dem sogenannten Reporter, und einem "Quencher" markiert. Der Quencher fängt bedingt durch die räumliche Nähe zum Reporter dessen Fluoreszenzstrahlung ab.
5. Während die Polymerase die DNA vervielfätigt, baut sie gleichzeitig die an die Erreger-DNS gebundene Gensonde ab: Reporter und Quencher werden voneinander getrennt und der Quencher ist nicht mehr in der Lage, die Fluoreszenzstrahlung anzufangen. Die Fluoreszenzstrahlung wird nun frei und kann gemessen werden. Je früher diese Strahlung messbar ist, desto höher ist die Konzentration des Erregers in der Pflanzenprobe. Die Freisetzung der Fluoreszenzstrahlung wird in "Echtzeit" (= Real-time) verfolgt.
6. Die freigesetzte Strahlung signalisiert die Anwesenheit des Schaderregers, nach dem gesucht wurde. Wird keine Strahlung freigesetzt, so ist dieser Schaderreger in der Proben nicht vorhanden. In diesem Fall muss die Suche nach der Schadursache weitergehen.

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