PCR-ELISA: Eine Methode zur Pathogendiagnose und Ermittlung der Befallsstärke
Der PCR-ELISA ist eine Methode zum Nachweis von Pflanzenpathogenen, in der molekularbiologische (PCR und Gensonden-Hybridisierung) und serologische Techniken kombiniert werden.
Gegenüber der konventionellen PCR (Polymerase-Kettenreaktion), die lediglich eine Unterscheidung zwischen "Befall" und "Nicht-Befall" zulässt, bietet der PCR-ELISA den Vorteil der Quantifizierung der Befallsstärke.
Der PCR-ELISA kann zum spezifischen und empfindlichen Nachweis von Pilzen, Bakterien, Viren und Viroiden eingesetzt werden. An der LfL wurde ein sehr sensitives PCR-ELISA-Verfahren zum Nachweis des Hop latent viroids (HLVd) erarbeitet (Knabel, 1999), das im Vergleich zur herkömmlichen PCR um den Faktor 10 empfindlicher ist.
Der PCR-ELISA eignet sich besonders für die parallele Untersuchung einer großen Anzahl von Proben in der Routinediagnostik. Im Vergleich zum ELISA oder zur herkömmlichen PCR sind allerdings, bedingt durch die Kombination beider Verfahren, die pro Probe anfallenden Kosten deutlich erhöht.
Einzelschritte
- Isolierung der Erbsubstanz des Erregers
- Durchführung der PCR unter Verwendung erregerspezifischer Primer
- Bindung der PCR-Produkte an eine Mikrotiterplatte
- Ankopplung einer erregerspezifischen Gensonde an das gebundene PCR-Produkt
- Serologischer Nachweis der Gensonde über eine Farbreaktion
- Messung der Färbung: Die Intensität der Färbung ist ein Maß für die Befallsstärke
Nach der PCR wird das PCR-Produkt an eine Mikrotiterplatte gebunden. Das PCR-Produkt bindet eine markierte Gensonde (Hybridisierungsreaktion). Ein Antikörper, an den ein Enzym gekoppelt ist, reagiert mit dieser Markierung. Das Enzym bewirkt in der Folge eine Farbreaktion. Die Stärke der resultierenden Färbung kann gemessen werden. Sie ist ein Maß für die Stärke des Befalls in der Pflanze.
Schaderreger-Nachweis mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreakion (Polymerase chain reaction, PCR) ist eine molekularbiologische Technik, die seit ihrer Erfindung durch den US-Amerikaner Kary B. Mullis im Jahr 1983 in immer mehr Bereiche der Grundlagen- und angewandten Forschung in der Molekularbiologie, Biochemie und Medizin Einzug gehalten hat.
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