Forschungs- und Innovationsprojekt
Digi-Test: Neue Direktnachweise für Kartoffelviren und -bakterien

Die Kartoffel Solanum tuberosum ist ein bedeutender ökonomischer Faktor in der konventionellen und ökologischen Landwirtschaft. Die Testung auf Krankheiten ist für den erfolgreichen Anbau von Zucht- und Vermehrungsmaterial unumgänglich. Ein Befall mit den Kartoffelviren PLRV (Potato Leaf Roll Virus) PVY, M, A, X und S (Potato Virus Y, M, A, X und S) kann bis zu 80% Ertragsminderung bedeuten (siehe Linkliste am Ende der Seite).

Der bisher etablierte, obligatorische Viren-Test vor der Pflanzgut-Ausbringung wird mit dem serologischen Verfahren ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt. Dies hat den Nachteil, dass jeder Virus einzeln und erst am Blatt getestet werden kann. Die dazu erforderlichen Arbeiten sind aufwendig, langwierig und benötigen hohe Glashauskapazitäten.
Auf Grund dessen wurden in den letzten Jahren bereits die sensitivere und schnellere Multiplex-qRT-PCR (Multiplex quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion) entwickelt, die mehrere Viren in einer Reaktion testet. Die bisher etablierten Reaktionen erfordern allerdings eine teure und zeitraubende Aufreinigung der Viren-RNA. Für ein Hochdurchsatzverfahren in der gängigen Virentestung muss deshalb nach effizienteren Möglichkeiten gesucht werden.

Schwarzbeinigkeit ist neben den Quarantänebakteriosen die bedeutendste Bakterienkrankheit in Kartoffeln. Sie kann chemisch nicht bekämpft werden. Sie wird in Europa verursacht durch die Bakterien Dickeya-Arten, Pectobacterium atrosepticum und Pectobacterium carotovorum subspezies carotovorum. In den letzten Jahren wurden zwei weitere, virulente Subspezies entdeckt, die erhebliche Feld- und Lagerschäden nach sich ziehen können: Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis und Pectobacterium wasabiae.
Latenter Befall mit Schwarzbeinigkeitsbakterien ist auf dem Feld nicht zu erkennen. Bei entsprechenden Witterungs- und Lagerbedingungen können sich die Erreger vermehren und zu großen Schäden führen. Demzufolge wird der Bedarf immer höher, das Pflanzgut vor der Ausbringung auf die häufigsten und virulentesten Bakterienarten zu testen. Aktuell kann auf mehrere Bakterien gleichzeitig in der konventionellen PCR getestet werden. Jedoch sind hier wieder aufwendige DNA-Extraktionen und Elektrophorese-Gelanalysen notwendig.

Im Rahmen der Forschungsarbeiten zur Methodenentwicklung „Blue LAMP“,Virustestung Kartoffel (Johanna Stammler, TUM und Adolf Kellermann, LfL, siehe Linkliste am Ende der Seite), das von der LfL beantragt und vom StMELF gefördert war, wurden Verfahren entwickelt, die ohne den zeit- und kostenintensiven Schritt der DNA-Extraktion auskommen (DiRT-Verfahren = Direct Reverse Transkriptase Quantitative PCR). Derzeit müssen für eine hohe Nachweissicherheit noch alle Viren einzeln getestet werden. Im Rahmen dieses Projektes werden diese Tests weiterentwickelt und in ein hochdurchsatzfähiges digitales Multiplex Verfahren eingearbeitet. Dieses Verfahren wird im zweiten Schritt auch auf Schwarzbeinigkeitserreger erweitert.

Die zu testenden 100 Kartoffeln pro Probe (oben) werden zu jeweils 10 Knollen gruppiert (gepoolt). Hieraus wird der Saft gewonnen und für jede Gruppe eine multiplexe DiRT-qPCR für Bakterien (links) und eine für Viren (rechts) durchgeführt. Dabei werden spezifische DNA-Abschnitte des jeweiligen Erregers amplifiziert. Die Fluoreszenz in der Probe steigt stetig an. Ab einem Schwellenwert der auftauchenden Kurve für den jeweiligen Erreger im Diagramm gilt die Probe als befallen. Für jeden Erreger wird ein anderer Farbstoff verwendet, so kann man die Kurven im Diagramm farblich unterscheiden.
Abkürzungen für die Erreger im Diagramm: Dick=Dickeya, Pcc=Pectobacterium carotovorum carotovorum, Pba=Pectobacterium atrosepticum, PVY und PVM=Potato Virus Y und M, PLRV=Potato Leaf Roll Virus=Blattrollvirus.

Die real-time DiRT-PCR Multiplexentwicklung für Viren und Bakterien wurde im Sommer 2017 abgeschlossen. Alle sechs Viren und Bakterien können mit der neuen multiplexen real-time DiRT-PCR zuverlässig in zwei Reaktionen auf Knollensaft nachgewiesen werden.

Die Validierung an einzelnen Knollen für Viren, d.h. die gleichzeitige Testung zufällig ausgewählter Knollen mit der herkömmlichen ELISA-Methode mit der neuen multiplexen real-time DiRT-PCR, wurde im Herbst 2019 abgeschlossen. Sie ist mit den statistischen Indizes für gut bis sehr gut bewertet und wird in einer wissenschaftlichen Fachzeitschrift veröffentlicht.
In dieser Testsaison 2020/21 wurde die Validierung in der Pooltestung abgeschlossen. Hier wurde die multiplexe real-time DiRT-PCR mit einer Extraktions-PCR-Methode und mit ELISA verglichen. Die Übereinstimmung ist diesmal durchweg sehr gut.

Nach dieser Erfolgsserie wurde die Methode in der Saison 2021/22 in die Routinetestung für Viren sehr erfolgreich eingeführt. Die multiplexe real-time DiRT-PCR wird dort nun weiterhin für den Großteil der zu testenden Pflanzkartoffelproben verwendet.

Fotos: Tobias Hase, StMELF