Monitoring von gefährlichen Virus- und Viroidinfektionen von Hopfen in Deutschland (Projekt)

Ausschluss „falsch negativer“ RT-PCR- und Realtime RT-PCR-Ergebnisse
Zusätzlich zum spezifischen Viroid- und Virusnachweis wird bei jeder einzelnen Probe eine Kontrolle zum Nachweis von Pflanzen-RNA mitgeführt. Da Pflanzen-RNA in jeder Probe enthalten ist und deshalb in jeder Probe nachweisbar sein muss, dient diese Kontrolle dem Ausschluss „falsch negativer“ Ergebnisse (Seigner et al. 2008): Ist der Nachweis von Pflanzen-RNA in einer Probe nicht möglich (beispielsweise weil Pflanzeninhaltsstoffe die PCR hemmen), so ist das ein negatives Viroid- oder Virusergebnis nicht aussagekräftig.

Der Nachweis mittels RT-PCR und Realtime RT-PCR ist sehr zuverlässig und unabhängig von Symptomen, die im Falle von HpSVd erst 3 bis 5 Jahre nach der Infektion auftreten. Im Falle einer positiven RT-PCR auf CBCVd oder HpSVd ist es zumindest bei Neubefall zur endgültigen Befallsfeststellung notwendig, die RT-PCR-Reaktionsprodukte aufzureinigen und in einem Auftragslabor die genetische Sequenz bestimmen zu lassen. Besteht weitestgehende Übereinstimmung in der genetischen Sequenz mit bekannten in GenBank® hinterlegten Gensequenzen, so ist Viroidbefall bestätigt.

Einen wesentlichen Arbeitsschwerpunkt stellte 2017 die Erarbeitung, Weiterentwicklung und Praxiserprobung hoch sensitiver Realtime RT-PCR-basierter Verfahren für Hopfenviroide und -viren dar, die den Nachweis sicherer und schneller machen. Die komplexe Pflanzenmatrix des Hopfens war dabei eine besondere Herausforderung. An der LfL wurden bereits für eine Reihe von Erregern solch moderne Nachweismethoden etabliert, validiert und so für Routinediagnosen nutzbar gemacht.

Hochsensitive und hochspezifische Methoden zum sicheren Nachweis von Pflanzenviren und –viroiden

Da die ersten Ergebnisse im Hinblick auf das Hopfenstauche-Viroid (HpSVd) und das Citrus bark cracking viroid (CBCVd, = Zitrus-Viroid, CVd IV) erfolgversprechend waren, wurden im Monitoringjahr 2017 erstmals alle Monitoringproben mit der Realtime RT-PCR unter Verwendung von HpSVd- und CBCvd-spezifischen Primern und Taqman-Gensonden getestet. Bei jeder Probe wurde zusätzlich eine interne, auf Pflanzen-mRNA-basierende Positivkontrolle mit untersucht. Der Viroid-spezifische Nachweis und der Nachweis der internen Positivkontrolle erfolgten im selben Realtime RT-PCR-Ansatz.

2017 wurde in keiner der 362 untersuchten Proben das Hopfenstauche-Viroid oder das Zitrus-Viroid nachgewiesen. Die interne Realtime RT-PCR-Kontrolle hat bei jeder Probe funktioniert. Dies zeigt ganz klar, dass mit dem neuen Realtime RT-PCR-Testverfahren ein stabiler und sicherer Nachweis in der Routine gewährleistet ist.

Auch die deutsche Hopfenproduktion wird durch zwei gefährliche Viroide, das Hop stunt viroid (HpSVd) und das Citrus bark cracking viroid (CBCVd = Zitrusviroid IV, CVd IV), bedroht (Jakse et al. 2015). Diese sehr leicht zu verschleppenden und nicht bekämpfbaren Viroide können hohe wirtschaftliche Verluste und Qualitätseinbußen verursachen. Das deutschlandweite Viroidmonitoring der LfL leistet einen wesentlichen Beitrag zur Prävention und Sicherung der Hopfenproduktion in Deutschland: Es ermöglicht, Erstbefall zu erkennen, primäre Befallsherde zu tilgen und eine flächenmäßige Verbreitung der gefürchteten Pathogene zu verhindern.

2016 wurde in keiner der 327 analysierten Probe wurden HpSVd oder CBCVd nachgewiesen. Beide gefährlichen Viroide konnten also noch keinen Einzug in den deutschen Hopfenanbau finden. Die Viroidgefahr ist jedoch aufgrund der weltweiten Befallssituation, des Imports sowie innergemeinschaftlichen Verbringens von Pflanzgut aus Befallsgebieten und fehlender Quarantäneregulierung weiterhin überaus groß. Das an der LfL durchgeführte Monitoring leistet zwar einen wesentlichen Beitrag zur Überwachung der Viroid-Befallssituation, dennoch ist das Monitoringraster relativ grob, sodass möglicherweise bereits bestehende Befallsnester noch nicht detektiert worden sind. Immer wieder werden in eingeführten Hopfen aus Befallsgebieten HpSVd-Infektionen festgestellt, wodurch die Problematik unterstrichen wird. Das massive Interesse der deutschen Hopfenpflanzer am Import und Anbau von Flavorhopfen aus den USA als HpSVd-Befallsland erhöht darüber hinaus das Einschleppungsrisiko beträchtlich. Die Testung insbesondere an Importhopfen und das Monitoring auf HpSVd und CBCVd werden deshalb konsequent und möglichst engmaschig fortgesetzt.

Im Monitoringjahr 2015 waren die Intensität der Probennahme und die Herkunft der Proben ähnlich wie in den Vorjahren. Im Gegensatz zu den Jahren 2011-2013 beschränkten sich 2015, wie auch schon 2014, die Tests auf HpSVd und CVd IV, das neuerdings Citrus bark cracking viroid (CBCVd) bezeichnet wird (Jakse et al. 2015). Auf die Testung auf die Hopfenviren AHpLV (Latentes Amerikanisches Hopfenvirus), ApMV (Apfelmosaikvirus), ArMV (Arabismosaikvirus), HpMV (Hopfenmosaikvirus) und HpLV (Latentes Hopfenvirus) wurde verzichtet, da die meisten dieser mechanisch und größtenteils durch Blattläuse übertragenen Hopfenviren, wie unsere Monitoringergebnisse der Vorjahre immer wieder zeigten, im deutschen Hopfengärten weit verbreitet sind. Allerdings spielt das ArMV im deutschen Hopfenanbau keine Rolle. Es wird empfohlen, bei der Anlage neuer Hopfengärten Pflanzmaterial zu verwenden, das auf Viren getestet ist, um zumindest in der Anfangsphase ein höheres Ertragsniveau zu erreichen. Insbesondere das ApMV und das HpMV können wirtschaftliche Einbußen verursachen, vor allem wenn sie in Mischinfektionen - auch mit anderen Viren - auftreten.

2015 wurden insgesamt 213 Hopfenpflanzen beprobt. 32 der beprobten Pflanzen wiesen dabei Auffälligkeiten bzw. verdächtige Symptome auf wie z. B. Vergilbung, schlechten Wuchs, eingerollte Blätter oder wurden insgesamt als „schwach“ eingestuft. Der Großteil der Proben stammte aus Deutschlands größtem Hopfenanbaugebiet, der Hallertau; 10 Proben wurden aus Tettnang eingereicht.

In keiner der im Jahr 2015 analysierten Proben wurde HpSVd oder CBCVd gefunden. Beide Viroide haben also noch keinen Einzug in den deutschen Hopfenanbau gefunden. Im Hinblick auf CBCVd, das vermutlich über Abfälle von Zitrus in Slowenien in den Hopfen eingeschleppt worden war (Radišek et al. 2013), ist zu betonen, dass 14 beprobte Hopfen mit Kompost gedüngt worden waren, 10 davon mit Biokompost. In keiner dieser Proben wurde CBCVd nachgewiesen. Wird Kompost in Hopfengärten ausgebracht, so ist es grundsätzlich wichtig, dass die Kompostierung unter optimalen Bedingungen vonstattengeht und die zur aeroben Hygienisierung notwendige Temperatur gleichmäßig im Komposthaufen verteilt ist. Allerdings spielt bei der Inaktivierung der Viroide in einer Kompostanlage nicht nur die Temperatur, sondern insbesondere auch das Zusammenwirken chemischer, biochemischer und biophysikalischer Vorgänge eine entscheidende Rolle (Radišek, persönliche Mitteilung). Die Frage, inwieweit ein Risiko bei der Ausbringung von Kompost besteht, ist noch endgültig zu klären.

Das Monitoringprogramm der letzten Jahre wurde 2014 im Hinblick auf die Beprobungsdichte und räumliche Verteilung der Probenahme wie in den Vorjahren fortgesetzt. Lediglich aus der Elbe-Saale-Region wurden keine Proben eingereicht. Im Gegensatz zu den Jahren davor beschränkten sich 2014 die Tests auf das HpSVd und CBCVd, da die weite Verbreitung der Hopfenviren durch die Monitoringergebnisse der Jahre 2011-2013 hinlänglich belegt ist. Insgesamt wurden 239 Proben untersucht. Das 2013 an der LfL neu etalierte Verfahren zum Nachweis des CBCVd wurde erfolgreich bei der Testung aller Proben eingesetzt. In keiner der im Jahr 2014 analysierten Proben wurde HpSVd oder CBCVd gefunden.

Im Monitoringjahr 2013 wurden insgesamt 279 Hopfen auf HpSVd (Hop stunt viroid = Hopfenstauchviroid) bzw. annährend 240 Proben auf das Apfelmosaikvirus (ApMV, Apple mosaic virus), das Arabismosaikvirus (ArMV, Arabis mosaic virus), das Hopfenmosaikvirus (HpMV, Hop mosaic virus) sowie das Latente Amerikanische Hopfenmosaikvirus (AHpLV, American hop latent virus) analysiert. Zwölf Proben, für die ein spezielles Risiko bestand, wurden auf das in Slowenien (Radišek 2013) unlängst nachgewiesene, äußerst aggressive Citrus bark cracking viroid (CBCVd = CVd IV, Zitrusviroid IV) getestet.

In keiner der auf HpSVd und CBCVd untersuchten Proben wurde eines der beiden gefürchteten Viroid nachgewiesen. Allerdings war die Anzahl der im Jahr 2013 auf CBCVd getesteten Proben zu gering, um von einer verlässlichen Datenbasis sprechen zu können. Diese Tests wurden in den Folgejahren intensiviert.

Besonders bemerkenswert ist, dass von den 62 % infizierten Hopfen 34 % mit einem und 29 % mit bis zu drei Viren infiziert waren. AHpLV kam zusammen mit ApMV (3 %) bzw. HpMV (6 %) vor. Die als ertragsrelevant betrachtete Mischinfektion von HpMV und ApMV (ohne AHpLV) war in 10 % der Hopfen nachweisbar. Darüber hinaus war bei 9 % aller Infektionen der Hopfen mit HpMV, ApMV und zusätzlich mit AHpLV befallen. Der Anteil an Mehrfachinfektionen könnte sogar noch höher liegen, da 2013 auf das bekanntermaßen häufig auftretende HpLV nicht getestet worden war.

2012 wurden insgesamt wurden 230 Hopfen auf HpSVd bzw. 229 auf Viren analysiert. Das gefährliche HpSVd wurde in keiner einzigen Probe detektiert.

Wie schon 2011 wurden Viren in erheblichem Ausmaß in den Monitoringproben festgestellt; da bevorzugt Hopfen mit Symptomen untersucht wurden, wird die tatsächliche Befallslage möglicherweise überbewertet. In nur 20 % aller Proben wurde kein Virus gefunden. Die als vergleichsweise kritisch eingestuften HpMV und ApMV wurden in 35 % bzw. 24 % der Proben nachgewiesen; das HpLV, das geringere Einbußen zu verursachen scheint und deshalb weitgehend toleriert wird, wurde in 59 % aller Fälle detektiert. Lediglich ArMV war mit einer Befallshäufigkeit von 2 % nur selten anzutreffen. In 9 von 53 stichprobenartig getesteten Proben konnte das AHpLV gefunden werden; folglich scheint auch dieses Virus in der Praxis verbreitet zu sein. Laut Angaben von Eastwell und Druffel (2012) mindert AHpLV den Dolden- und Alphasäurengehalt. Insgesamt waren fast 75 % aller Hopfen mit den Blattlaus-übertragbaren Carlaviren (HpMV und/oder HpLV; AHpLV nicht eingeschlossen) befallen. Hervorzuheben ist außerdem, dass in 36 % aller Proben Mischinfektionen mit verschiedenen Viren vorlagen. So waren z. B. 13 % aller Hopfen gleichzeitig mit HpMV und HpLV infiziert; in 6 % waren HpMV wie auch ApMV und in weiteren 6 % HpMV, HpLV und ApMV zusammen anzutreffen. Insbesondere Mischinfektionen mit HpMV und ApMV werden als ertragsrelevant betrachtet.

In keiner der im Jahr 2011 auf HpSVd untersuchten 280 Hopfenproben wurde das gefürchtete Viroid nachgewiesen.

Ein anderes Bild ergibt sich für den Großteil der getesteten Hopfenviren, obgleich durch die bevorzugte Beprobung symptomzeigender Hopfenpflanzen die tatsächliche Befallssituation möglicherweise überschätzt wird: Nur 42 von insgesamt 246 auf alle Viren (AHpLV bleibt unberücksichtigt wegen nicht in ausreichender Zahl durchgeführter Analysen) getesteten Hopfen, also knapp 17 % der beprobten Pflanzen, erwiesen sich als virusfrei.

HpLV wurde in 60 % von insgesamt 250 untersuchten Proben detektiert, HpMV in 66 % und ApMV in 36 % der analysierten Proben; lediglich ArMV fand sich in weniger als 1 % der Proben. In 6 von 10 stichprobenartig untersuchten Proben amerikanischen Ursprungs wurde das AHpLV mit der RT-PCR gefunden.

Hervorzuheben ist ferner, dass häufig Mischinfektionen mit unterschiedlichen Viren vorlagen. Vier verschiedene Viren wurden in zwei Proben detektiert: neben ArMV waren auch noch HpLV, HpMV sowie ApMV vorzufinden. In 50 von 246 analysierten Proben waren drei Viren gleichzeitig anwesend: neben den beiden Carlaviren HpMV und HpLV (AHpLV ist wegen der nur stichprobenartig durchgeführten Analysen dabei nicht berücksichtigt) war auch ApMV anzutreffen. In 61 Proben waren HpMV und HpLV zusammen anwesend. ApMV und HpMV waren in 25 Hopfen vergesellschaftet, HpLV und ApMV in 6. Jeweils nur ca. 11 % aller Proben waren allein mit HpLV oder allein mit HpMV und nur ca. 3 % ausschließlich mit ApMV infiziert.