Abteilung Qualitätssicherung und Untersuchungswesen
Jahresbericht 2018 – Bedeutung und Verbleib von Clostridium difficile und anderen neuartigen Erregern in landwirtschaftlichen Biogasanlagen
Clostridium difficile sowie andere ggf. antibiotikaresistente Erreger, insbesondere Extended-Spectrum-Beta-Laktamase bildende E. coli (ESBL) und Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), können schwerwiegende Infektionen bei Menschen und Tieren hervorrufen. Bisher gibt es kaum Informationen zum Vorkommen und Verhalten dieser Krankheitserreger in Biogasanlagen. Ziel dieses Forschungsvorhabens war es, qualitative und quantitative Daten zum Vorkommen und zur Überdauerungsfähigkeit von C. difficile, ESBL-bildenden E. coli und MRSA in Biogasanlagen zu gewinnen. Das Verbund-Projekt der Bayerischen Landesanstalt für Landwirtschaft (LfL) und des Bayerischen Landesamtes für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) sowie dem Center for Biotechnology der Universität Bielefeld (CeBiTec) gliederte sich in drei Themenschwerpunkte. Zunächst sollten schnelle und spezifische molekularbiologische Nachweisverfahren für C. difficile, MRSA und ESBL-bildende Enterobakterien entwickelt und wichtige Toxin- und Antibiotikaresistenzgene identifiziert werden. Um das Vorkommen von C. difficile, ESBL-E. coli und MRSA in der Prozesskette (Einsatzstoffe, Fermenterinhalte und Gärprodukte) zu untersuchen, sollten ausgewählte bayerische Praxis-Biogasanlagen untersucht werden (Screening). Des Weiteren sollten Keimträgerversuche in Laborbiogasanlagen mit nicht krankheits-auslösenden C. difficile Stämmen durchgeführt werden, um das Verhalten von C. difficile bei mesophilen und thermophilen Prozessbedingungen zu analysieren.
Methode
Die kulturellen und/oder molekularbiologischen Nachweissysteme für C. difficile, ESBL- E. coli und MRSA wurden erfolgreich an der LfL etabliert. Der Nachweis der untersuchten Erreger erfolgte über eine Kombination aus kultureller Anreicherung und molekularbiologischer Detektion mittels quantitativer Real-Time-PCR (qPCR). Im Rahmen des Vorhabens wurden dabei qPCR-Systeme für den Nachweis der C. difficile Toxine A und B (TcdA und TcdB) sowie für das binäre Toxin (CDT) entwickelt und evaluiert. Die Analyse-Pipeline „Metagenomics rapid gene identification pipeline“ (MeRaGENE) der Universität Bielefeld wurde speziell für die Zielsetzungen dieses Projekts angepasst.
Ergebnisse
Im Rahmen des Biogasanlagen-Screenings wurden an der LfL insgesamt 220 Proben aus 14 ausgewählten Praxisanlagen auf das Vorkommen von C. difficile untersucht. Davon waren 41 % Einsatzstoffe pflanzlicher Herkunft (z.B. Silagen), 16 % Substrate tierischen Ursprungs (z.B. Gülle, Mist), 26 % Fermenterinhalte (Hauptgärer) und 17 % Gärgemische aus nachgeschalteten Stufen (Nachgärer, Endlager). In allen untersuchten Prozessstufen konnte C. difficile nachgewiesen werden. Dabei waren pflanzliche Substrate mit einer Nachweisrate von ca. 11 % deutlich geringer belastet als tierische Eingangsstoffe (62 %). Für Fermenterin-halte betrugen die Nachweisraten 83 % und für Gärprodukte 87 %. Bei einem Großteil der C. difficile Isolate konnten auch Toxingene detektiert werden. Aufgrund der hohen Nachweisraten von C. difficile in den Praxisanlagen (51 %) wurden insbesondere Fermenterinhalte und Proben aus nachgeschalteten Stufen quantitativ mittels Most-Probable-Number Verfahren (MPN) untersucht. Den Ergebnissen zufolge war die Konzentration von C. difficile in allen untersuchten Proben (n=9) allerdings verschwindend gering (<20 MPN·gFM-1). Am LGL wurde bei einer Nachweisrate von 14 % deutlich weniger C. difficile als an der LfL nachgewiesen. Von den insgesamt 121 untersuchten Biogasanlagen-Proben wurde C. difficile lediglich aus 17 Proben isoliert, wobei quantitative Analysen (n=17) eine sehr geringe Keimzahl in den Biogasanlagen-Proben bestätigten (≤43 MPN·gFM-1).
Zoombild vorhanden
Clostridium difficile auf Selektiv-Agarplatte
Für das Screening auf ESBL-bildende E. coli wurden insgesamt 310 Proben (LGL + LfL) untersucht. Dabei konnten ESBL- bildende E. coli aus 12 Proben, insbesondere aus tierischen Substraten (u.a. Rinder- und Geflügelmist sowie Rinder- und Schweinegülle), isoliert werden. Zusätzlich wurden zwei E. coli Isolate als AmpC-ß-Laktamase Bildner identifiziert. Neben ESBL/AmpC-ß-Laktamase bildenden E. coli konnten auch andere Antibiotika-resistente Keime wie z.B. Ochrobactrum spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Achromobacter spp. oder Stenotrophomonas spp. gefunden werden. MRSA konnten in keiner der am LGL analysierten Proben (n=251) detektiert werden.
Zoombild vorhanden
Reduktion von C. difficile in mesophilen und thermophilen Keimträgeruntersuchungen
In mesophilen Keimträgerversuchen (38 °C) mit apathogenen C. difficile Stämmen wurde eine Reduktion um 90 % (D-Wert) im Mittel innerhalb von 10,8 ± 3,0 d (ohne Taurocholsäure) bzw. 19,7 ± 7,3 d (mit Taurocholsäure) erreicht. Eine deutlich schnellere Reduktion von C. difficile wurde unter thermophilen Bedingungen (55 °C) beobachtet. Hier lagen die D-Werte bei 4,1 ± 1,0 d (ohne Taurocholsäure) bzw. bei 3,0 d (mit Taurocholsäure) (siehe Abbildung rechts).
Zusammenfassend zeigten die Untersuchungsergebnisse, dass ein Eintrag von C. difficile und ESBL-bildenden E. coli in die Biogasanlage primär über tierische Substrate erfolgt. Während ESBL-Bildner fast ausschließlich in den tierischen Eingangsstoffen nachgewiesen wurden, konnte C. difficile vielfach auch in den Gärgemischen (Fermenterinhalten) und in den Gärprodukten gefunden werden. Allerdings war die Konzentration von C. difficile in den untersuchten Proben sehr gering. Keimträgerversuche ergaben unter meso- und stärker noch unter thermophilen Bedingungen eine eindeutige Reduktion von C. difficile. Es gab keine Hinweise darauf, dass sich C. difficile, ESBL-E. coli oder Antibiotikaresistenzgene im Biogasprozess vermehren. MRSA konnten in keiner Biogasanlage nachgewiesen werden.
Dr. Michael Lebuhn
Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft
Abteilung Qualitätssicherung und Untersuchungswesen
Tel.: 08161 71-3978
E-Mail: Michael.Lebuhn@lfl.bayern.de